各位老铁们好，相信很多人对wb二抗孵育时间都不是特别的了解，因此呢，今天就来为大家分享下关于wb二抗孵育时间以及二抗孵超过一个小时会如何的问题知识，还望可以帮助大家，解决大家的一些困惑，下面一起来看看吧！
本文目录
一、wb二抗孵育条件
该实验二抗孵育条件是二抗稀释、孵育时间、孵育环境、孵育后的清洗。
1、二抗稀释：二抗以1：5000至1：10000的比例稀释在封闭液或tbst中。
2、孵育时间：二抗孵育的时间在室温下0.5至1小时左右，在室温下孵育1至2小时。
3、孵育环境：二抗孵育的环境是室温，不需要冷藏。
4、孵育后的清洗：二抗孵育后，使用TBST在室温下清洗两次，每次10分钟。
二、wb实验的原理和步骤
WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上，再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原。
与相对应的之一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理 *** ，其余的样品制备 *** 参阅相关文献。
2.弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3.加入1X SDS样品缓冲液，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。
4.超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。
1.玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
2.配 10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
3.当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4.配 4％的浓缩胶,加入 TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5.用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
6.在电泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液，上样。
7.连接电泳槽到电泳仪。上槽接负极,下槽接正极，通电起始电压70～ 80V，10min后100V，电泳2h或当溴酚蓝迁移至离底部1cm时，停止电泳。
1.将胶浸于转移缓冲液中平衡 10min。注意：若检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
2.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和 3-5秒钟。
3.装配转移三明治:海绵3层滤纸胶膜，3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记:胶放于负极面(黑色面)。
4.将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液，插上电极，100V，1h(电流约为 0.3A)。
5.转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。
1.用25ml TBS洗膜5min，室温，摇动。
2.置膜于25ml封闭缓冲液中1h,室温，摇动。
4.加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。
6.加入合适稀释度的碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。
将 A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于 A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。
取出胶片立即完全浸入显影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
信号强度低是指在正常曝光条件下得到的目的条带微小或是没有目的条带，而增加曝光时间又会招致背景高、杂带多等问题。扫除试剂质量、操作失误等方面的影响，这一类问题产生的主要缘由如下：
①样本蛋白表达量缺乏。倡议添加蛋白表达量较高的细胞系作为阳性对照，或是恰当增加上样量以取得较高程度的信号；
②蛋白质降解。在蛋白样品制备期间留意蛋白酶抑止剂 PMSF的运用，所制备的样品尽快检测或妥善保管；
③蛋白的转膜。运用恰当孔径的膜，同时优化转膜时间，关于高分子量蛋白可能需求更长的转膜时间。
④抗体的运用。抗体的反响种属与实验类型需求可以满足实验的需求，此外，抗体的稀释比、孵育时间等问题也需求在实验中不时优化；
⑤蛋白与抗体分离率低。减少洗膜次数或缩短洗膜时间，降低洗膜液中 NaCl浓度等；
⑥抗原被封锁液遮盖。换用不同的封锁液，优化封锁液中蛋白质浓度并缩短封锁时间；
⑦甲醇浓渡过高。会招致蛋白质与 SDS别离，并沉淀在凝胶中，同时使凝胶收缩或变硬，从而抑止高分子量蛋白的转移。实验中可恰当降低甲醇浓度或者运用乙醇、异丙醇替代。
二、非特异性条带或条带位置不对
WB结果中目的条带之外的条带被称为非特异性条带，有时非特异性条带很明显，却没有目的条带，这些状况对结果剖析会产生很大的干扰。普通来说惹起这类问题的主要要素有：
①抗体的非特异性分离。通常以为，多抗的特异性不如单抗，更容易产生非特异性条带，而恰当降低抗体的浓度有助于减少杂带。同时为了扫除二抗非特异性分离的可能，倡议设二抗阴性对照；
②样品蛋白量过高。恰当降低上样量，同时延长洗濯时间与封锁时间可防止蛋白量过高对实验结果的不良影响；
③蛋白质降解。会招致条带位置变化并产生更多杂带，倡议采用新颖制备的或是冻融次数较少的样品；
④细胞传代次数过多。会招致蛋白表达形式的分化，倡议运用原始或传代少的细胞株；
⑤蛋白存在复合物。有的目的蛋白会和其他蛋白分离构成复合物，招致条带位置改动，需求查阅相关文献来肯定蛋白能否会构成稳定复合物；
⑥蛋白存在剪接体或多种修饰方式。局部蛋白存在剪切位点，有的剪切体具有免疫活性，在 WB中也会被检测出。此外有的目的蛋白会存在糖基化位点或其他修饰位点，条带大小可能会远超理论分子量。因而需求查阅文献或是 uniprot来得知蛋白的剪切体大小以及修饰位点等。
在局部 WB结果中，条带之外本应是空白的背景也会有较深的颜色，对剖析结果会产生干扰，而且结果图不美观，难以用于文章发表。这种问题的可能缘由有以下几点：
①封锁不充沛。背景过高的主要缘由之一是封锁有问题，倡议运用适宜的封锁剂（脱脂奶粉、BSA等），优化反响浓度与封锁时间，同时留意防止呈现抗体与封锁剂的穿插反响，以及封锁剂与含有目的抗原，内源性生物素或者与抗生物素蛋白/链霉亲和素不相溶等问题；
②洗膜不充沛。恰当增加洗膜次数弛缓冲液体积，进步吐温20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的问题；
③抗体的运用。一抗浓渡过高是高背景的缘由之一，且二抗也存在与封锁剂非特异性分离的可能，因而倡议恰当优化一抗浓度，并设二抗阴性对照；
④曝光时间长。倡议在实验中采用适宜的曝光时间。
有时 WB结果图中条带位置契合预期，但却由于条带弥散、外形怪异等要素招致无法运用，呈现这种状况多半是制胶或电泳过程出了问题，详细如下：
①电泳时电压、电流过高。会招致条带迁移速率过快以及 SDS-PAGE温度升高，并可能使得条带弥散、外形变形。倡议运用适宜的电泳条件并坚持低温；
②电极不均衡。会招致条带偏斜，上样时在无样品的胶孔中参加等量样品缓冲液可防止这种状况；
③上样量过高，样品中盐离子浓度较大。上样量过高可能会招致条带弥散，样品中的盐离子浓度不分歧则会招致条带不齐等问题。因而在上样时需保证样品量分歧且恰当，并坚持相同的、较低的盐离子浓度。
④制胶问题。在配胶时一定要保证充沛混匀，平均凝胶，上样前用针头将胶孔拨正并吹出胶孔中的气泡。
⑤电泳缓冲液寄存过久。电泳实验中的缓冲液假如放置过久也会对结果有不良影响，因而倡议及时改换新的缓冲液。
有时在 WB做出结果后，除了目的条带以外，膜上还散布着不规律的污点，对结果也会有较大的干扰。这类问题产生的主要缘由有以下几点：
①试剂、仪器等污染。倡议在每次实验前后留意清算实验仪器，同时及时改换呈现问题的试剂；
②转膜时有气泡。确保在转膜过程中将气泡扫除洁净；
③抗体孵育时与膜接触不充沛。确保在抗体孵育过程中，液体总量足够，同时将抗体平均配置，并在摇摆的条件下停止孵育；
④曝光时间。过度曝光会招致斑点更明显，倡议采用适宜的曝光时间；
⑤膜枯燥。实验中要保证有充沛的反响液，防止呈现干膜现象。
三、western二抗孵育多久
1、根据查询二抗说明说得知，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1~2小时后，回收二抗。
2、孵育时间的设定主要是为了确保二抗能够充分地与一抗结合。孵育时间过短，会导致二抗与一抗的结合不充分，影响到后续的信号检测。
四、wb二抗室温几小时
1、二抗一般室温就行,没要求要37度,一个小时差不多就够了。
2、蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验 *** 。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
3、蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。
4、蛋白免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
五、二抗孵育时间超过两小时会怎么样
1、二抗孵育时间超过两小时会导致抗体失活、非特异性背景信号增加和结果可靠性下降。
2、二抗孵育时间过长可能会导致抗体失活，因为抗体在长时间的孵育条件下可能会发生结构变化或降解，从而影响其与目标蛋白结合的能力。此外，长时间的孵育还可能导致非特异性背景信号的增加，这是因为在孵育过程中，二抗可能会与非特异性蛋白结合，从而产生干扰性的信号，掩盖了目标蛋白的信号。最后，二抗孵育时间过长会降低实验结果的可靠性，因为长时间的孵育可能引入更多的变量和误差，使得实验结果的解释和使用变得不准确。
六、wb二抗常温孵育时间长会怎样
该实验孵育时间过长，可能会产生以下影响：
1、抗体失活：二抗孵育时间过长可能导致抗体失活，从而影响其与目标蛋白的结合能力。
2、非特异性背景信号增加：二抗孵育时间过长还可能导致非特异性背景信号的增加，从而掩盖目标蛋白的信号，使得检测结果不准确。
3、结果可靠性下降：二抗孵育时间过长会导致实验结果的可靠性下降，从而影响实验结果的解释和使用。
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